Giovanni Balducci est formé à l'atelier de Giovanni Battista Naldini, sous l'influence de Giorgio Vasari et du maniérisme tardif florentin. Entre 1575 et 1579, il collabore avec Federico Zuccaro dans les fresques du Giudizio Universale de la coupole de Brunelleschi à Santa Maria del Fiore de Florence. Il est inscrit à l'Accademia delle Arti del Disegno en 1578.

De 1577 à 1580, il travaille avec les Naldini sur les fresques de la chapelle Altoviti de l'église et abbaye de la Trinité-des-Monts à Rome.

Retourné ensuite à Florence, il fait partie du groupe d'artistes rassemblés autour d'Alessandro Allori et avec lesquels il décore les plafonds des couloirs du dernier étage des Uffizi.

En 1589, pour les noces de Ferdinand Ier de Médicis et de Christine de Lorraine, presque tous les ateliers de peintres de la ville sont mobilisés, pour la création d'appareils de la scénographie et il participe en particulier aux décorations de Santa Maria del Fiore, où demeure une Cène qu'il a peinte. La même année il peint le mariage mystique de Saint Catherine à l'église Sant'Agostino de San Gimignano.

De 1588 à 1590, il peint, ce qui est considéré comme son chef-d'oeuvre, pour le cardinal Alexandre de Médicis, un cycle de la vie du Christ à l'oratoire des Pretoni, connu aussi sous le nom de l'oratoire de Jésus pèlerin (Oratorio di Gesù Pellegrino), Via San Gallo à Florence.

Dans sa peinture cohabitent les marques du classicisme du Quattrocento, dans le rendu des faces, et les caractères de dévotion de la peinture sacrée florentine du moment, dominée par l'influence de Santi di Tito.

Entre 1590 et 1591, de nouveau avec les Naldini, il travaille à la décoration du dôme de Volterra, où il peint il Miracolo dei pani e dei pesci (le miracle des pains et des poissons) dans la chapelle Serguidi. La Natività à Volterra est datée de 1592. Au début du nouveau siècle, il part à Naples, où aussi il est aussi actif. il y meurt en 1631.